Хроматографическое определение химического состава чая

Я.И. Яшин, А.Я. Яшин, П.И. Черноусова
Научно-технический центр «Хроматография» НПО «Химавтоматика»

Первое упоминание о чае было 5 тыс. лет назад в Китае, в провинции Юньнань.

В настоящее время чай — наиболее распространенный напиток в мире, его употребляют 2 / 3 населения земного шара, причем значительно чаще, чем кофе. Ежегодно в 40 странах мира производят более 3 млн. т чая. Основные производители чая (тыс. т): Индия — 850, Китай — более 700, Шри-Ланка — около 300, Кения — 270, Индонезия — 150, Япония — более 100, Южная Африка — около 100, Вьетнам — 75, Аргентина — 50.

Общее производство и продажу чая оценивают в 20 млрд долл. США. Цена некоторых элитных сортов чая достигает более 1000 долл. США за 100 г.

В мире имеется более 3000 коммерческих сортов чая. хотя чайного растения Camellia sinensis всего два вида.

В зависимости от степени ферментации чай классифицируется на зеленый, желтый, белый, красный и черный. Зеленый чай производится без предварительной ферментации, желтый, белый и красный — с частичной ферментацией и черный чай — с полной ферментацией. В основном потребляются черные и зеленые сорта чая, их производят примерно в соотношении 80 и 20 %.

Наилучшие условия для выращивания чая — влажный и жаркий климат, условия вечной весны. В таких условиях чайное растение быстро растет, постоянно дает новые побеги. На качество чая влияют многие природные факторы: влажность, температура, высота, время сбора, тип почвы, близость гор или моря. Естественно, качество чая зависит также от технологии переработки, хранения, упаковки и пр.

В последние годы интерес к чаю значительно возрос из-за высокого содержания в нем сильных антиоксидантов. В настоящее время признано, что причина многих болезней, а также процесса старения людей — действие свободных радикалов в биологических жидкостях, которые, как сильные окислители, повреждают стенки сосудов, мембраны клетки, окисляют липиды. Эти воздействия приводят к сердечно-сосудистым, онкологическим заболеваниям, диабету и многим другим опасным болезням.

Систематическое употребление чая подавляет вредное воздействие свободных радикалов в биологических жидкостях человека.

Сильная антиоксидантная активность чая в основном связана с катехинами, присутствую щ ими в больших количествах. особенно в зеленом чае.

В последние годы появились многочисленные научные публикации о предотвращении и подавлении онкологических заболеваний полифенолами чая [1–5], в частности катехинами зеленого чая [6­–8], теафлавинами черного чая [9] общие обзоры на темы: чай и рак [10], чай и здоровье [11,12], предотвращение рака полифенолами чая и оптимизация здоровья [13], исцеление чаем [14] и многие другие.

Хроматография чая

В настоящее время химический состав разных сортов чая широко исследуется хроматографическими методами. Современные хроматографические методы наиболее пригодны как для рутинных, так и для исследовательских анализов. В последние годы вышли десятки обзоров и статей по анализу чая хроматографическими методами. Для определения компонентов чая используют основные аналитические методы хроматографии: газовой, жидкостной, ионной [15–21].

Для идентификации неизвестных соединений применяют комбинированные методы: газовую хроматографию — мас-спектрометрию, высокоэффективную жидкостную хроматографию — мас-спектрометрию, жидкостную хроматографию — ИКС, жидкостную хроматографию — ЯМР.

Для выделения катехинов в чистом виде из экстрактов зеленого чая используют препаративную жидкостную хроматографию, для выделения теафлавинов в чистом виде применяют противоточную хроматографию.

Для повышения чувствительности анализа применяют метод микротвердофазной экстракции, а также концентрирование на специальных адсорбционных картриджах.

Катехины и другие компоненты чая определяли не только в водных настоях, но и в биологических жидкостях организма человека после употребления чая, в частности, в моче, плазме, желудочном соке, слюне [16].

Для определения химического состава чая чаще всего применяют высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) с УФ-детектором [19]. Кроме того, используют электрохимические (амперометрические и кулонометрические) [16, 17], масс-спектрометрические, флуоресцентные и хемилюминесцентные детекторы.

Газовую хроматографию с пламенно-ионизационным детектором применяют для анализа органических летучих компонентов, определяющих аромат чая.

В последние годы для анализа состава чая используют также методы капиллярного электрофореза, в основном зонный капиллярный электрофорез и мицеллярную электрокинетическую капиллярную хроматографию. Реже применяют методы тонкослойной и бумажной хроматографии.

Для анализа компонентов чая используют и другие методы: спектрофотометрию, хемилюминесценцию, ЯМР, биосенсоры, ИКС. В Японии разработан и выпускается ИКС-анализатор чая. Несмотря на огромные возможности методов хроматографии и других методов, официальные методы контроля чая — органолептические или устаревшие аналитические методы. Весьма актуально скоррелировать заключения дегустаторов чая с результатами химического анализа чая современными хроматографическими методами. Химический анализ чая позволил бы связать качество чая и его полезные и лечебные свойства с содержанием определенных компонентов и тем самым оптимизировать технологию производства чая. Аромат чая определяется многими летучими соединениями. В табл. 1 приведен перечень классов и число соединений, идентифицированных методом ГХ-МС в аромате черного чая [20].

Всего идентифицировано около 500 летучих соединений. Среди летучих соединений обнаружены также разные производные фурана, пиррола и др. Считается, что спирты образуются в чайных листьях за счет биосинтеза. Однако большинство летучих соединений чая образуются в процессе технологической обработки из каротиноидов, липидов и аминокислот.

Для идентификации соединений, определяющих аромат чая, используют метод ГХ-МС в сочетании с методом концентрирования «head-space» (анализ равновесного пара).

Перечень соединений, анализируемых в чае хроматографическими методамиприведен в табл. 2.

Ниже приведены сведения о содержании соединений, представленных в табл. 2, в разных сортах чая хроматографическими методами.

Катехины (флавонолы). В зеленом чае выявляют от 4 до 12 типов катехинов, которые составляют до 15–30 % от сухого листа. Структурные формулы восьми наиболее часто встречающихся катехинов изображены на рис. 1. Как указано выше, эти катехины — сильнейшие антиоксиданты. В черном чае содержится только 9 % катехинов, так как в процессе ферментации они окисляются в теафлавины и теарубигины. Содержание катехинов в зеленом чае, определенных хроматографическими методами, колеблется от 10 до 120 мг / г (на 1 г сухого чая) в зависимости от сорта и качества чая. Больше всего содержится четыре типа катехинов: эпигаллокатехин (ЭГК), эпигаллокатехин галлата (ЭГКГ), эпикатехин (ЭК) и эпикатехин галлата (ЭКГ). В меньших количествах встречаются галлокатехин, катехин и галлокатехин галлат.

Хроматограмма катехинов зеленого чая, полученная на жидкостном хроматографе «ЦветЯуза» (НПО «Химавтоматика») с амперометрическим детектором в окислительном режиме, приведена на рис. 2. В этом случае регистрируются только соединения, способные окисляться. Предел детектирования катехинов на «ЦветЯузе» — на уровне нг/мл, линейный диапазон — от 5 до 1000 нг/мл. На рис. 3 приведено сопоставление хроматограмм черного и зеленого чая. зарегистрированных в одинаковых условиях. Из данного рисунка видно, что состав этих сортов чая сильно различается.

Было определено суммарное содержание катехинов в чае после заварки в течение 5–120 мин. Оказалось, что общее содержание катехинов возрастает во времени (рис. 4) до 20 мин. Из этих данных следует, что наибольшая антиоксидантная активность зеленого чая после 20 мин заварки. Измерения были выполнены с помощью прибора «ЦветЯуза-01-АА» (анализатора антиоксидантной активности) НПО «Химавтоматика». В табл. 3 приведена антиоксидантная активность (АОА) зеленых и черных сортов чая. Данные опубликованы в работе [22], измерения были выполнены также на приборе «ЦветЯуза-01-АА». Есть прямая связь антиоксидантной активности чая с качеством его исходного сырья. Антиоксидантная активность чая в основном связана с содержанием катехинов, особенно это справедливо для зеленого чая. В рекламной литературе на чай приводятся сведения, что в почке может содержаться до 30 % катехинов от сухой массы, в первом листочке — 25 %, во втором листочке — 20 % и т. д. Из табл. 3 видно, что антиоксидантная активность зеленого чая в среднем в 3 раза выше, чем черного.

В работе [23] определены катехины в трех сортах китайского зеленого чая, в двух сортах зеленого японского чая, в черном японском чае и в порошковом зеленом японском чае методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором. Суммарное содержание катехинов в разных сортах китайского зеленого чая (Luan Guapian, Longjin, Maofeng) было соответственно 91.6, 100,4 и 123,3 мг /г (на 1 г сухого чая), в японских (suntory, dynasty) — 86,8; 95.4 мг/л, в черном чае (hoji-cha) — 11,5 мг, в зеленом японском порошковом чае (sunphenon) — 170,5 мг/г. 

Следует обратить внимание, что катехинов в черном чае содержится в 8-15 раз меньше, чем в зеленом. Наибольшее число катехинов содержится в порошковом зеленом чае, используемом на чайных церемониях. Из общего содержания катехинов в зеленом чае 54–70 % составляет EGCG, 8–19 % — EGC, 9–12 % — ECG, 2–8 % — ЕС, все остальные — менее 5 %.

В работе [19] методом ВЭЖХ были определены четыре основных катехина, галловая кислота и кофеин в зеленых сортах чая (Meifo, Shanghai, Jasmine, Hangzhon Lung Ching), «Оолонг» (Fajian, Jiangxi), черный чай (Fujian) и Pu-erth.

Содержание катехинов в зеленых сортах чая (мг/г) EGCG: в пределах 51–63, EGC — 27–37, ECG — 11–22, ЕС — 7–10, соответственно. В чае «Оолонг» содержание этих катехинов в 2–2,5 раза меньше. В черном чае в 10 раз меньше. Содержание галловой кислоты во всех образцах чая колебалось в пределах 0,4–5 мг/г, содержание кофеина — в пределах 0,7–3 мг/г.

Капиллярным электрофорезом были определены основные катехины, кофеин, теофиллин и аскорбиновая кислота в зеленых сортах японского чая sencha и gyakuro [24] (мг/л): EGCG — 300–500, ECG — 60–120, EGC — 140–450, ЕС — 51–150. Содержание кофеина обнаружено в пределах 160–260 мг/л, теанина — 230–250 мг/л и аскорбиновой кислоты — 30–80 мг/л. 

Катехины определяли в биологических жидкостях (плазме, слюне и моче) через 1 ч после употребления чая. Было обнаружено в плазме EGCG — 170–180 мкг/л, EGC — 150–160, ECG — 85–87, ЕС — 64–71 мкг/л [16].

Теафлавины содержатся в черном чае в пределах 3–6 % (от сухой массы), от их содержания зависит интенсивность оранжево-красного цвета чая. В зеленом чае этих соединений мало. В процессе ферментации катехины под воздействием окислительной реакции, катализируемой энзимами, превращаются в теафлавины. Методом ВЭЖХ смесь разделяется: теафлавин, теафлавин-3-галлат, теафлавин-З.З’-галлат [20]. С труктурные формулы теафлавинов приведены на рис. 5.

Теарубигины — высокомолекулярные соединения с молекулярной массой в пределах 1 000–40 000 Da [20], в черном чае их может содержаться в пределах 12–18 % от сухой массы. Теарубигины придают более интенсивное окрашивание заварке чая, чем теафлавины. Разные фракции теарубигинов извлекали этилацетатом, диэтиловым эфиром, н-бутаном. При определенных условиях теарубигины разлагали на антоцианидины, галловую кислоту и флавонолы. 

Методом гельхроматографии разделяли теарубигины и детектировали спектро-фотометрическим детектором при длинах волн 440–460 нм.

Пуриновые алкалоиды. Содержание кофеина в черном чае колеблется в пределах 1,5–4 %, теобромина— 0,2–0,4 % и теофиллина — менее 0,02 % [19]. В литературе продолжаются дискуссии о пользе и вреде кофеина. В США широко распространено употребление чая без кофеина.

Аминокислоты. В чае определяют следующие свободные аминокислоты: глутамин, аспарагин, аланин, треонин, серин, пролин, изолейцин, лейцин, метионин, глутаминовую кислоту, гистидин, фенилаланин, тирозин. Их содержание в зеленом чае в пределах 0,1–10 мг/г [18]. Содержание аминокислот в зеленом чае служит критерием его качества, в частности содержание теанина в японском зеленом чае служит показателем его высокого качества. Он придает деликатный вкус настоям чая. В последние годы теанин отнесен к антиканцерогенным соединениям, он также уменьшает содержание норадреналина и серотонина в мозгу, снижает давление. В некоторых сортах японского зеленого чая теанин содержится в пределах 8–10 мг/г, глутамин — в пределах 1,5–3 мг/г. Структурная формула теанина приведена на рис. 5.

Сахара. В зеленом чае в основном содержатся: глюкоза — в пределах 0,6 -1,3 мг/г, фруктоза — 0,4–0,9 мг/г и сукроза — 6–1 0 мг/г. Разработан простой, эффективный и прямой метод одновременного определения свободных аминокислот и сахаров с использованием анионообменной хроматографии и амперометрического детектора с золотым рабочим электродом [18]. Ранее эти анализы выполняли с пред- или послеколоночной дериватизацией сахаров.

Витамины. Опубликованы методики анализа витаминов чая методами хроматографии, в частности витамина С, витамина Е (токоферолов α, β, γ). В чае обнаружены также витамин К. почти все витамины группы В и редкий витамин Р, укрепляющий стенки кровеносных сосудов и предотвращающий внутренние кровоизлияния.

В чае методом ВЭЖХ с амперометрическим детектором определяют аскорбиновую кислоту. В зеленом чае ее обнаружено около 1,7–2 мг/г . Витамина Е найдено на порядок меньше. Количество витаминов С и Е сильно уменьшается после ферментации, поэтому в черном чае этих витаминов содержится значительно меньше; α-β-каротиноиды и хлорофиллы определяются в зеленом чае также методом ВЭЖХ.

Катионы и анионы. Методом ионной хроматографии и капиллярного электрофореза в чае выявляют катионы щелочных и щелочноземельных металлов, аммоний, а также основные анионы, включая оксалаты, могут образовывать камни в почках. Для сердечной деятельности особенно важно высокое содержание калия в чае. Из-за возможной токсичности AI разработаны методики его определения с послеколоночной дериватизацией методом эксклюзионной хроматографии. Тяжелые металлы определяли в растворах чая методом ВЭЖХ с индуктивно связанной плазмой в качестве детектора [20].

Кислоты. Основная фенольная кислота в чае — галловая (рис. 5). В нем присутствуют и эфиры галловой кислоты, в частности теогаллин. Содержание галловой кислоты в китайских образцах чая определено в пределах 0,4–1,6 мг/г (от сухой массы).

Методом капиллярного электрофореза одновременно определяют щавелевую, яблочную, лимонную, хинную и аспарагиновую кислоты.

Анионообменная хроматография была применена для определения уксусной, аскорбиновой, сукциновой, яблочной, лимонной, щавелевой, фосфорной, соляной и серной кислот одновременно.

Из приведенного краткого обзора видно, что методы хроматографии широко применяют для исследования состава чая. К сожалению, пока имеются трудности при анализе теарубигинов, пептидов и белков.

Из вышеприведенных сведений бесспорно следует, что наиболее полезен зеленый чай, так как он содержит катехины в неокисленной форме, а они обладают наибольшей антиоксидантной активностью. Кроме того, зеленый чай содержит на порядок больше витаминов С и Е. В статье [22] приведены исследования по антимутагенной активности чая. Многие экспериментальные данные убедительно подтверждают сильный антимутагенный эффект от воздействия зеленого чая.

Проведены клинические испытания воздействия употребления зеленого чая на рост опухолей. Отмечена задержка роста опухолей. Планируются новые обширные клинические испытания. 

Считается, что употребление 5-10 чашек зеленого чая в сутки защищает от появления опасных заболеваний.

В черном чае много летучих химических соединений, большинство из которых в лучшем случае неполезны, некоторые вредны. В связи с этим предлагается два разных способа заварки черного чая.

Первый способ — традиционный, рекомендуемый всеми фирмами-производителями. Предлагается употреблять чай после 5 мин заварки кипящей водой. Этот чай возбуждающий, он содержит много кофеина, но также содержит много синтетических химических соединений, образовавшихся при окислении ферментами.

Второй способ — чай заваривается, перемешивается и через 1–1,5 мин этот настой сливается, затем снова заливается и настаивается 5 мин и более. Такой чай содержит меньше низкомолекулярных летучих химических соединений (польза от которых, как уже указано, сомнительна) и меньше кофеина. Этот чай успокаивающий и более полезен, чем чай, заваренный по первому способу. При заварке по второму способу мало теряется полезных катехинов.

ЛИТЕРАТУРА

  1. Ahmad N., Katiyar S.K., Mukhtar Н. Cancer chemoprevention by lea polyphenols, in: C. lonnides (Ed.). Nutrition and chemical toxicity. — Wiley, West Sussex, UK. 1998. pp 301–343.
  2. Katiyar S.K., Mukhtar Н. Tea in chemoprevention of cancer: epidemiologic and experimental studies / / Int. J. Oncol. 1996. 8. 221–228.
  3. Katiyar S.K., Mukhtar Н. Tea antioxidants in cancer chemoprevention / / J. Cell. Biochem. Suppll. 1997. 27. 59–67. 
  4. Cheng S., Ding L., Zhen Y., Lin P., Zhu Y., Chen Y., Hu X. Progress in studies on the antimutagenicity and anticancerogenicoty of green tea epicatechins / / Chin Med. Sci. J. 1991. 6. 233-238.
  5. Kuroda Y., Hara Y. Antimutagenic and anticarcinogenic activity of tea polyphenols / / Mutat. Res. 1999. 436. 69–97. 
  6. Shim J. S., Kang M. H., Kim. Y. H., Roh J.K., Roberts C., Lee I.P. Chemopreventive effect of green tea (Camellia sinensis) among cigarette smokers / / Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev. 1995. 4. 387–391.
  7. Valcic S., Timmerman B.N., Alberts D.S., Wacchter G. A., Krutzsch M., Wymer J., Guillen J.M. Inhibitory effects of six green tea catechins and caffeine on the growth of four selected human tumor cell line / / Anticancer Grugs. 1996. 7. 461–468.
  8. Fujiki H., Suganuma M., Okabe S., Sueka N., Komori A., Sueka E.,  Kozu T., Tada Y., Suga K., Imai K., Nakachi K. Cancer inhibition by green tea / / Mutat. Res. 1998. 402. 307–310.
  9. Shiraki M., Hara Y., Osawa T., Kumon H., Nakayama T., Kawakishi S. Antioxidative and antimutagenic effects of theaflavins from black tea / / Mutat. res. 1994 .323. 29–34.
  10. Yang C.S., Wang Z.Y. Tea and cancer / / J Natl. Cancer Inst. 1993. 85. 1038–1049.
  11. Weisburger J.H. Tea and health: the underlying mechanisms / / Proc. Soc. Exp.Biol.Med. 1999. 220. 271–275.
  12. Yang C.S. Tea and health. Nutrition 1999. 15. P. 946–949.
  13. Mukhtar H., Ahmad N. Tea polyphenols: prevention of cancer and optimizing health / / Am. J. Clin. Nutr. Suppl. 2000. 71. 1696S-1702S.
  14. Antol M.N. Healing Teas — New York: Avery Publishing Group, 1996.
  15. Dalluge J.J., Nelson B.C. Determination of tea catechins / / Review. J. Chromat. 2000. V. 881. P. 411–424.
  16. Lee M.-J., Prabhu S., Meng X. el. Al. An improved Method for Determination of Green and Black Tea Polyphenols in Biomatrices by High-Performance Liquid. Chromatography with Coulometric Array Detection / / Anal. Biochem. 2000. № 279. V. 164–169.
  17. Brunner W.E., Bucher G.R. Method for determining the content of catechins in tea infusions by high-performance liquid chromatography / / J. Chromat. 1998. V.805 P. 137–142.
  18. Ding Y., Yu H., Mou S. Direct determination of free amino acids and sugars in green tea by anion-exchange chromatography with integrated pulsed amperometric detection / / J. Chromat. 2002. V. 982 P. 237–244.
  19. Zuo Y., Chen H., Deng Y. Simultaneous determination of catechins, calleine, and gallic acids in green Oolong, black and pa-erth teas using HPLC with a photodiode array detector. — Talanta, 2002. V. 57. P. 307–316.
  20. Finger A., Kuhr S., Engelhardt U.H. Chromatography of tea constituents / /J. Chromat. 1992. V. 624. P. 293–315.
  21. Arce L., Rios A., Valcarcel M. Determination oi anti-carcinogenic polyphenols present in green lea using capillary electrophoresis coupled to a flow injection system / / J . Chromat. 1998. V. 827. P. 113–120.
  22. Gupta S., Soha В., Giri A.K. Comparative antimutagenic and anticlastogenic effects of green tea and black tea: a review / / Mutation Research 2002 V. 512. P. 37–65
  23. Identification and determination of polyphenols in tea by liquid chromatography with multi-channel electrochemical detection. 2000. 30. marth.